摘 要:本文從蛋白質(zhì)檢驗的原理和操作步驟入手,對各操作步驟中應(yīng)注意的問題作了詳細分析,從而達到提高檢測準確性的目的。
關(guān)鍵詞:凱氏定氮法;測定;蛋白質(zhì)
蛋白質(zhì)是構(gòu)成一切細胞和組織結(jié)構(gòu)必不可少的成分。它是人類生命活動重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。在人體細胞中 ,蛋白質(zhì)約占 1/ 3 ,成年人體內(nèi)平均約含蛋白質(zhì)16.3 %。蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的主要功能是: (1)構(gòu)成酶、 激素、 抗體以及機體組織。(2)促進人體生長發(fā)育。(3)維持毛細血管滲透壓。(4)供給人體部分能量。在生命活動中蛋白質(zhì)無處不在 ,而且具有多種多樣的重要功能。生物體一旦失去蛋白質(zhì) ,一切生命活動即將停止 ,生命終結(jié)。所以說 ,蛋白質(zhì)是生命物質(zhì) ,也是食品中重要的營養(yǎng)指標。
食品中的蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機化合物 ,分子量很大 ,他們由 20 種氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來 ,并具有一定的空間結(jié)構(gòu) ,所含的主要化學(xué)元素為C、 H、 O、 N ,含氮則是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機化合物的主要標志 ,凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)即是通過測定氮的含量 ,然后乘以蛋白質(zhì)的換算系數(shù)得到蛋白質(zhì)的含量。
1 凱氏定氮法的原理
凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)的原理是樣品與濃硫酸、 硫酸鉀、 硫酸銅一同加熱消化 ,使蛋白質(zhì)分解 ,其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出 ,而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨和硫酸結(jié)合成硫酸銨 ,然后加堿蒸餾 ,使氨蒸出 ,用硼酸吸收后再以標準鹽酸溶液滴定 ,根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。
2 蛋白質(zhì)測定中各步驟的反應(yīng)方程式
(1)消化
2NH2 (CH2) 2COOH + 13H2SO4 =Δ(NH4 ) 2SO4 + CO2x + SO2 x + 16H2O
(2)蒸餾
在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉是呈堿性 ,加熱蒸餾即可釋放出氨氣 ,其反應(yīng)方程式如下:
NaOH + (NH3) 2SO4 = 2NH3 x + Na2SO4 + H2O
(3)吸收
加熱蒸餾所放出的氨 ,可用硼酸溶液進行吸收 ,其反應(yīng)方程式如下:
2NH34H2BO3 = (NH4) 2B4O7 + 5H2O
(4)滴定
(NH4) 2B4O7 + 5H2O + 2HCl = 2NH4Cl + 4H3BO3
現(xiàn)在隨著實驗室儀器的發(fā)展，多數(shù)手工操作都被凱氏定氮儀取代
3 凱氏定氮法檢驗中應(yīng)注意的事項
(1)樣品應(yīng)盡量選取具有代表性的 ,大塊的固體樣品應(yīng)用粉碎設(shè)備打得細小均勻 ,液體樣要混合均勻。
(2)稱量放入凱氏燒瓶時 ,應(yīng)小心 ,不要讓樣品粘附在燒瓶的頸部 ,否則會使頸部上粘附的含氮化合物在無硫酸存在的情況下未消化完全而造成氮損失。
(3)消化過程中不要用強火 ,特別是樣品脂肪或糖含量較高時 ,消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫 ,強火會使樣品溢出瓶外或濺起粘附在凱氏燒瓶壁上無法消化完全而造成氮損失 ,因此應(yīng)在開始消化時用小火加熱 ,保持和緩沸騰 ,使火力集中在凱氏燒瓶底部。
(4)消化過程中要不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶 ,以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進其消化完全。
(5)樣品中脂肪含量過高時 ,要增加硫酸的量 ,因消化時脂肪消耗硫酸量大 ,使硫酸缺少不能生成硫酸銨造成氮損失。
(6)消化至液體澄清透明后只需繼續(xù)加熱 015h 即可 ,加熱過久 ,硫酸不斷被分解 ,水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大 ,沸點升高 ,易使已生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失 ,特別是蛋白質(zhì)含量低的食品因此而無法測定。
(7)在蒸餾前應(yīng)檢查蒸餾裝置的密封情況 ,加氫氧化鈉的漏斗要采用水封 ,避免因蒸餾裝置漏氣造成氨的逸出而影響測定結(jié)果。
(8)滴定用的標準酸必須按照標準配制和標定 ,標準酸濃度的準確度將影響檢驗數(shù)據(jù)的準確性。
(9)為了提高檢測數(shù)據(jù)的準確性 ,減少隨機誤差 ,檢驗一個樣品一定要進行平行試驗。
凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)含量的步驟較多 ,在檢驗過程中應(yīng)注意以上事項 ,減少在各步驟中的實驗誤差 ,以提高檢測結(jié)果的準確度。
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